超分辨显微成像系统

尼康新一代N-STORM 超分辨显微成像系统

与N-STORM相比，N-STORM 4.0的图像采集速度提高了10倍，使得活细胞纳米级分辨率图像的拍摄成为了可能。2015年3月15日，N-STORM 4.0在德国哥廷根的“聚焦显微镜”会议上首次亮相，并于3月底正式上市。
自从2010 年N-STORM发布以来，尼康在超分辨显微镜领域一直处于领先地位。N-STORM基于由哈佛大学霍华德休斯医学研究所庄小威博士开发的随机光学重构显微技术，其原理是通过荧光分子的闪烁，暂时分离出单个的荧光分子并对其进行精确定位，从而重构出纳米级分辨率的图像（分辨率是传统光学显微镜的10倍）。N-STORM 4.0作为N-STORM 的升级产品，实现了活细胞动态过程的超分辨成像。
2014年的诺贝尔化学奖授予了超分辨显微镜领域，这证明超分辨显微镜技术正得到越来越多的关注，与此同时，超分辨技术应用扩展的需求也在增加。最新的研究表明，基于随机光学重构的超分辨技术实现了活细胞动态超分辨成像，前所未有的观察到了细胞内结构的纳米级动力学过程，如黏着斑1，网格蛋白小窝中的转铁蛋白簇2，线粒体和内质网等细胞器3。
N-STORM 4.0 实现了激光激发设计和sCMOS相机的升级，单张图像的采集速率从分钟级提高到秒极。另外，新系统在成像视野的选择上提供了更高的灵活性，用户可以选择活细胞高速成像模式，或者选择固定细胞的大视野成像模式，以适应不同的应用需求。

1 Shroff, H. et al., 2008, Nature Methods, 5 (5), p417-423.
2 Jones, S.A. et al., 2011, Nature Methods, 8 (6), p499-505.
3 Shim, S-H. et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci., 109, p13978-13983. 

 ► 主要特点

 |  纳米级水平的动态超分辨成像

    新升级的光学和照明系统，完美匹配sCMOS相机。
    图像采集速度比N-STORM提升近10倍，单张图像拍摄时间从分钟级提高到秒级。
    活细胞动态超分辨成像，分辨率比传统光学显微镜提高10倍。

80umX80um（拍摄分辨率512X512），拍摄速度30Hz；

40umX40um（拍摄分辨率256X256），拍摄速度100Hz；

20umX20um(拍摄分辨率128X128)，拍摄速度500Hz。

  |  高质量的超分辨成像 

     新升级的照明放大镜提高了激光的激发效率，使得单位面积的荧光分子密度增加。
     采集足够数量荧光分子所需时间更短，图像采集速度显著提高。
     单位时间内采集到的荧光分子数更多，图像清晰度显著提高。

（左）用Alexa For For®647标记的微管用N-STORM 4.0成像（具有20秒采集时间）

（右）与常规的N-STORM系统（20秒采集时间）相同的样品成像

* Alexa For是Telo Fisher科学公司的注册商标。

 |   宽视野的超高分辨率成像

    新开发了成像系统中间变倍体，实现更大视野拍摄。
   80μm x 80μm大视野成像，成像区域是前一代N-STORM的4倍。

左：成像范围宽4倍，80μm×80μm（宽视模式）      右：常规模型的成像面积，40μm×40μm

样品：线粒体ToM20与AlEXA64 7结合

 |  多重漂移矫正机制

    1）自相关漂移矫正算法，可矫正XYZ三维方向上的位置漂移。

    2）以荧光小球或其他发光颗粒进行定位标记参照，进行三维方向上的漂移矫正。

 |  N-STORM成像物镜

    HP (High Power) 物镜与高功率激光相匹配，使荧光基团发生快速闪烁。
    改进轴向色差校正，提高多色荧光的3D成像精度。

CFI HP Apochromat TIRF 100x oil         CFI HP Plan Apochromat VC 100x oil

超分辨率荧光显微镜技术大大的超出了传统光学显微镜的分辨率极限

    N-STORM是一种超分辨率数字显微镜系统的新技术，该技术将“随机光学重构显微术”（哈弗大学授权）与尼康的Eclipse Ti研究级倒置显微镜结合在了一起。N-STORM能够显著提高分辨率可达到传统光学显微镜分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集纳米级的二维或三维多光谱图像，横向分辨率接近20nm轴向分辨率也接近50nm。N-STORM将光学显微镜的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

远大于传统光学显微镜的分辨率

与传统荧光显微镜不同，STORM并没有在同一时间观察样品中所有的荧光标记分子，在某一时间点她只是激活其中的一小部分。重复这一过程可获得多张图像，在这些图像中分子以纳米的精度定位，组合这些图像将最终重构出超级的分辨率。

 通过重叠单分子图像构建超分辨率的影像

“STORM”这一新技术是通过多次曝光进而运算得到荧光团的高精度定位信息，通过整合这些信息而重构出高分辨率的荧光图像（2D或3D）。这一技术可获得更多丰富的细节信息，并更进一步使对样品的理解从结构水平进化到分子水平。

 以超高的分辨率获取三维信息

“STORM”技术通过多次曝光可运算得到荧光团高精度的Z轴定位信息，对这些信息进行重构即可获得纳米级分辨率的荧光3D图像。正如单个分子可在x-y的维度中被定位一样，N-STORM的3D组件同样可在Z轴中确定单个分子的位置从而获得高精度的3D超分辨率图像。

 独特的多色彩技术

采用不同有机染料的混合物可以实现多色彩的成像。这些染料是一种独特的可以通过短波长激光活化而发光的荧光探针，通过不同波长的激光激发而成为彩色图像：起始时这类探针处于非活化的状态，随后他们由一特殊波长的激发光激发而产生荧光。这一过程可使各个荧光团分别发光，从而相互区分开来，进而多次捕获的图像可以经过编辑成为最终具有超高分辨率的图像。

 简单，灵活的配置

尼康已有的标准硬件配置让N-STORM能最大程度的使用户获益。这也意味着超分辨率的能力可以添加到领导市场的尼康Ti-E倒置显微镜上面或者是新出品的A1R共聚焦显微镜系统上面使用，N-STORM可轻易的配合已有产品搭建多功能的系统