双光子显微镜

站在共聚焦成像与双光子显微术的最高水平上

 尼康的A1R MP 是一款拥有独到技术的双光子显微成像系统，不仅具备高分辨率检流计式扫描器（galvanometer scanner），而且还配备了高速共振式扫描器（resonant scanner）。扫描速率在512 X 512像素水平下高达到30帧/秒；在带状扫描模式下最高可达420帧/秒。新型四通道NDD探测器（non-descanned detectors）具有更高的探测效率、更低的暗电流以及更宽的响应光谱，可以对谱线相近的荧光探针进行实时光谱拆分与识别，并大大提高荧光图像的对比度。此功能对于双光子显微镜非常重要，因为在双光子成像时一般只能使用单一的激发波长，往往不可避免地造成自发荧光以及发射光谱的重叠。

 New 新型A1R MP+扫描头与新型正置反射GaAsP NDD，现已销售。可使用1300nm红外激光，提供前所未有更深层的高灵敏度成像。

     配合Ni-E正置显微镜

  | 高达420帧/秒成像速率的共振扫描镜     

 尼康所特有的共振扫描技术，较之于非共振的普通扫描器，大幅提高了宽视场扫描速率，达到了点扫描成像的世界最快速率420帧/秒（512X32）。同时在512X512分辨率下亦可以实现30pfs的成像速度（FOV:18mm）。利用多光子显微术专用的NDD探测器，可以对非常厚的标本进行深部快速成像。尼康的光学同步（optical pixel clock）技术充分保证了超高速图像的均匀性和稳定性。 

*1 NDD（Non-Descanned Detector）,与共聚焦技术不同，A1R MP不需要使用小孔滤波（descan）。使得NDD探测器可以安装在最靠近物镜出光口的位置，从而可以接收到更多的被厚标本散射的信号光，大幅提高灵敏度。

 | 高速与高质兼备，独有同步光活化         

  A1 MP+型配备检流计扫描头（非共振）可实现4096X4096高分辨率与10fps高速率成像（512X512）。

  A1R MP+型配备混合型扫描头同时整合检流计扫描镜与超高速共振扫描装置。最新的A1R MP+可实现1300nm红外脉冲光的使用。

   独特的混合型扫描头可提供双扫描装置同步工作，在检流计扫描装置进行光活化工作时共振扫描装置同步进行高速成像。是研究细胞内瞬时的变化的绝佳工具。

A1R MP+混合扫描头 

Resonant scanner：共振扫描振镜

Galvano scanner：检流计扫描振镜

 | 高灵敏度NDD深部成像

 尼康新开发的多光子四通道NDD探测器能够有效地进行标本深部的显微成像。较普通探测器而言，NDD的感光元件面积更大，灵敏度更高，并安装于距离物镜后出光口（back aperture）最近的地方. 该配置有效地提高了对散射荧光的探测效率，具有更高的信噪比（S/N），对诸如活体组织等较厚的标本的拍摄，具有比普通共聚焦显微镜更为清晰稳定的图像质量。

四通道反射NDD         四通道透射NDD

*对于标本深部成像来说，非常重要的一点就是要尽可能多地探测到散射荧光。而实际探测深度主要取决于探测器的灵敏度、受光面积以及安装位置。

活体小鼠大脑皮层深层成像

  H品系5周龄小鼠使用开颅发研究大脑皮层。通过表达EYFP可见layer V椎体细胞的完整树突结构，底层与表层都可见。同时亦可观察到更深白质区域的荧光。

左侧）三维重构图像      右侧）Z轴切层图像

上：layer V表层椎体神经元树突，距表面25μm。

中：layer V椎体神经元底部树突，距表面625μm。

底：白质荧光。

激发波长：950nm

物镜：CFI75 Apo 25xW MP (NA 1.10 WD 2.0)

Photographed with the cooperation of:
Dr. Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University
Dr. Shigenori Nonaka, National Institute for Basic Biology
Dr. Takeshi Imamura, Graduate School of Medicine, Ehime University

小鼠大脑皮层多色成像

 麻醉YFP-H小鼠使用950nm红外激发光同时采集三通道图像，其中包含SHG（ Second Harmonic Generation）图像与两通道荧光图像。

青：硬脑膜SHG信号 黄：EYFP显示椎体神经元  红：SRB标记血管

Photographed with the cooperation of:
Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

 | 超高灵敏度GaAsP NDD探测器  New  

  GaAsP（磷砷化镓）NDD可具有两倍于普通NDD的灵敏度，可拍摄前所未有的活体样品更深层的图像。其更高的灵敏度可以更为快速的获取图像并进行更高质量的Z轴拍摄。高灵敏度也可以更低功率的激光进行荧光成像，依减少对活体样品的光损伤。

  除了可以使用1080nm激光的类型外，我们还为正置显微镜提供兼容1300nm的类型。这一新型NDD配合新研制的扫描头利用1300nm激光可以开到深达1.4mm的深层图像。

活体小鼠深层大脑成像（1300nm GaAsP NDD）

  活体麻醉YFP-H小鼠（4周龄）开颅。可见完整layer V的椎体神经元及更深层海马神经元。大脑深层海马树突的三维深层成像。

  使用反射1300nm型GaAsP NDD探测器，CFI Apochromat 25xW MP1300物镜（NA 1.10, WD 2.0 mm）。 激发波长：1040nm

Photographed with the cooperation of: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

 活体小鼠大脑GaAsP NDD双色成像

   活体麻醉YFP-H小鼠（4周龄）开颅观察大脑皮层，Alexa594尾静脉注射法显示血流。

Photographed with the cooperation of: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

  | 新款高NA物镜成像更清晰，更明亮        

      新款水浸物镜在较宽的波长范围内做了色差校正，并利用尼康专利——纳米水晶镀膜*技术——保证了在近紫外到近红外波段内都有很高的透过率。

      如CFI75 Apochromat 25xW MP/MP1300物镜提供业内领先的1.10数值孔径同时保持2mm的工作距离，它还具有校正环校正样品深度同时提供33度尖端家教可用于电生理实验。此物镜是深层多光子成像与生理学研究应用的理想选择。

*一种原来为尼康半导体光刻机开发的超低折射率薄膜。由纳米颗粒组成海绵状“粗糙”结构，从而在很宽的光谱区间上大幅提升了光线透过率，获得更高信噪比的图像。

CFI75 Apochromat 25xW MP       CFI Apochromat 40xWI λS

CFI Plan Apochromat IR 60xWI  CFI Apochromat LWD 40xWI λS  

双光子物镜：

 | 快速精准的光谱拆分     

 A1R MP不仅可以通过光谱探测器进行32通道的光谱拆分，而且实现了利用四通道NDD探测器的光谱拆分功能。此功能同样适用于高速共振扫描器。因此，A1R MP可以实现厚标本的深部高速高对比度成像。

拆分前                  拆分后

（85nm红外激发三色同时成像） 

 | 多光子激光光束的一键准直     

当多光子激光的波长或群速色散（GVD）预补偿发生改变时，激光的位置会发生偏移，导致荧光图像亮度不均匀，以及单光子图像与双光子图像之间的错位。
由于人眼无法看见多光子激光，特别是800 nm以上波长。因此多光子激光束的准直工作对普通用户来说是十分困难也是十分危险的。尼康的A1R MP新开发的自动光束准直功能可以让用户轻点鼠标，NIS-Element C软件瞬间完成多光子激光的光束准直。